Kea leboha ha u etetse Nature.com.U sebelisa mofuta oa sebali o nang le tšehetso e fokolang ea CSS.Bakeng sa boiphihlelo bo botle ka ho fetesisa, re khothaletsa hore o sebelise sebatli se ntlafalitsoeng (kapa o tima Compatibility Mode ho Internet Explorer).Ho feta moo, ho netefatsa ts'ehetso e tsoelang pele, re bonts'a sebaka sena ntle le mekhoa le JavaScript.
Li-slide tse bonts'ang lingoloa tse tharo selaeteng se seng le se seng.Sebelisa likonopo tse ka morao le tse latelang ho tsamaea ka har'a li-slide, kapa likonopo tsa selaoli se qetellong ho tsamaea selaeteng ka seng.

317 Bafani ba li-tubing tsa tšepe tse sa hloekang

Tafole ea ho hlophisoa ha lik'hemik'hale ea thepa ea tšepe e sa hloekang

SPCA6 ke protheine e hlahisoang ka holim'a peō e bohlokoa bakeng sa motsoako oa gamete nakong ea ho ikatisa ka thobalano.Ho sa tsotellehe karolo ena ea bohlokoa, mosebetsi o khethehileng oa SPCA6 ha o utloisisoe hantle.Re hlakisa sebopeho sa kristale sa sebaka sa extracellular sa SPCA6 ka qeto ea 2.2 Å, ho senola protheine ea li-domain tse peli tse entsoeng ka bongata bo mekato e mene le li-sandwich tsa Ig-joaloka β tse kopantsoeng ke lihokela tsa quasi-flexible.Sebopeho sena se tšoana le IZUMO1, protheine e 'ngoe e amanang le fusion ea gamete, e etsang hore SPCA6 le IZUMO1 e be litho tse thehileng lelapa le phahameng ka ho fetisisa la liprotheine tse amahanngoang le manyolo tseo ho buuoang ka tsona mona e le IST superfamily.Lelapa le leholo la IST le hlalosoa ka mokhoa o hlophisitsoeng ka bongata ba li-helix tse 'nè tse sothehileng le li-motif tsa CXXC tse amanang le disulfide.Patlisiso e thehiloeng ho AlphaFold ea proteome ea motho e bonts'itse litho tse ling tsa protheine tsa lelapa lena le leholo;haholo-holo, bongata ba liprotheine tsena li ameha ho fusion ea gamete.Sebopeho sa SPCA6 le kamano ea sona le litho tse ling tsa IST superfamily li fana ka sehokelo se sieo tsebong ea rona ea ho kopana ha gamete ea mammalian.
Bophelo ba motho e mong le e mong bo qala ka li-gamete tse peli tse arohaneng tsa haploid: peō ea ntate le lehe la ’mè.Peō ena ke mohlodi oa ts'ebetso e matla ea khetho eo ka eona limilione tsa lisele tsa peō li fetang ka har'a karolo ea botšehali, li hlola litšitiso tse fapaneng1 le ho ba le matla, e leng ho ntlafatsang motility ea tsona le tšebetso ea likarolo tsa bokaholimo2,3,4.Esita le haeba peō le oocyte li fumanana, mokhoa ona ha o e-s'o fele.Oocyte e pota-potiloe ke lera la lisele tsa cumulus le mokoallo oa glycoprotein o bitsoang zona pellucida, oo peō ea botona e lokelang ho feta ka eona ho kena oocyte.Spermatozoa e sebelisa motsoako oa limolek'hule tsa ho khomarela holim'a metsi le li-enzyme tse amanang le membrane le tse patiloeng ho hlōla litšitiso tsena tsa ho qetela5.Limolek'hule tsena le li-enzyme li bolokiloe haholo-holo ka har'a lera le ka hare le matrix acrosomal 'me li fumanoa ha lesela le ka ntle la peō le lysed nakong ea acrosomal reaction6.Mohato oa ho qetela leetong lena le matla ke ketsahalo ea ho kopanngoa ha peō le lehe, moo lisele tse peli li kopanyang lera la tsona hore e be ntho e phelang ea diploid7.Le hoja ts'ebetso ena e le ea bohlokoa ho tsoaleng ha batho, litšebelisano tse hlokahalang tsa limolek'hule ha li utloisisoe hantle.
Ntle le manyolo a li-gametes, k'hemistri ea ho kopanngoa ha li-bilayers tse peli tsa lipid e ithutoe haholo.Ka kakaretso, ho kopanngoa ha membrane ke ts'ebetso e sa thabiseng ka matla e hlokang hore protheine e thusang ho etsa phetoho ea sebopeho e tlisang li-membrane tse peli haufi, ho senya tsoelo-pele ea tsona le ho baka fusion8,9.Li-catalyst tsena tsa protheine li tsejoa e le fusogens 'me li fumanoe lits'ebetsong tse ngata tsa fusion.Lia hlokahala bakeng sa ho kena ha kokoana-hloko liseleng tse amohelang (mohlala, gp160 ho HIV-1, spike in coronaviruses, hemagglutinin influenza viruses) 10,11,12 placental (syncytin)13,14,15 le fusions-forming fusions in eukaryotes e tlase ( HAP2/GCS1 ho limela, li-protists le arthropods) 16,17,18,19.Li-fusogens tsa li-gamete tsa batho ha li e-so fumanoe, leha liprotheine tse 'maloa li bonts'itsoe li le bohlokoa bakeng sa sehokelo sa gamete le fusion.CD9 e hlahisoang ke oocyte, protheine ea transmembrane e hlokahalang bakeng sa ho kopanya litoeba le li-gametes tsa batho, e bile eona ea pele e fumanoeng 21,22,23.Le hoja ts'ebetso ea eona e nepahetseng e ntse e sa tsejoe hantle, karolo ea ho khomarela, sebopeho sa adhesion foci on egg microvilli, le / kapa sebaka se nepahetseng sa liprotheine tsa oocyte holim'a metsi ho bonahala eka ke 24,25,26.Liprotheine tse peli tse tloaelehileng tse bohlokoa haholo bakeng sa ho kopanngoa ha gamete ke protheine ea sperm IZUMO127 le eocyte protein JUNO28, 'me ho kopana ha tsona ke mohato oa bohlokoa oa ho lemoha le ho khomarela pele ho kopanngoa.Litoeba tse tona tsa Izumo1 le litoeba tse tšehali tsa Juno li nyopa ka ho felletseng, mefuteng ena peo ea botona e kena sebakeng sa perivitelline empa li-gamete ha li fuse.Ka ho tšoanang, confluence e ile ea fokotseha ha li-gametes li ne li phekoloa ka li-anti-IZUMO1 kapa li-antibodies tsa JUNO27,29 litekong tsa batho ba in vitro fertilization.
Haufinyane tjena, ho fumanoe sehlopha se sa tsoa sibolloa sa liprotheine tse hlahisoang ke peō ea botona tse tšoanang le IZUMO1 le JUNO20,30,31,32,33,34,35.Protheine e amanang le "sperm acrosomal membrane-associated protheine 6 (SPCAA6) e 'nile ea khetholloa e le ea bohlokoa bakeng sa manyolo thutong e kholo ea murine mutagenesis.Ho kenngoa ha transgene ka har'a liphatsa tsa lefutso tsa Spaca6 ho hlahisa spermatozoa e sa tsitsang, le hoja li-spermatozoa tsena li kenella sebakeng sa perivitelline 36.Lithuto tse latelang tsa ho kokota ho litoeba li netefalitse hore Spaca6 e hlokahala bakeng sa fusion ea gamete 30,32.SPCA6 e hlahiswa hoo e ka bang ka ho kgetheha ka hara diteko mme e na le paterone ya sebaka se tshwanang le ya IZUMO1, e leng ka hare ho intima ya spermatozoa pele ho karabelo ya acrosomal, ebe e fallela sebakeng sa equatorial kamora karabelo ya acrosomal 30,32.Li-homologues tsa Spaca6 li teng liphoofolong tse fapa-fapaneng tse anyesang le tse ling tsa eukaryote 30 'me bohlokoa ba eona bakeng sa motsoako oa gamete oa motho bo bontšitsoe ka ho thibela ho nonosoa ha motho ka hare ho vitro ka ho hanyetsa SPCA6 30.Ho fapana le IZUMO1 le JUNO, lintlha tsa sebopeho, litšebelisano, le ts'ebetso ea SPCA6 li lula li sa hlaka.
Ho utloisisa hamolemo tšebetso ea motheo e theiloeng ho kopanngoa ha peō ea botona le mahe a motho, e leng ho tla re nolofalletsa ho tseba ka tsoelo-pele ea nakong e tlang ea thero ea malapa le phekolo ea kemolo, re ile ra etsa liphuputso tsa meralo le tsa biochemical tsa SPCA6.Sebopeho sa kristale sa sebaka sa extracellular sa SPCA6 se bonts'a bongata ba li-helical tse 'nè (4HB) le sebaka se kang sa immunoglobulin-like (Ig-like) se kopantsoeng ke libaka tse quasi-flexible.Joalokaha ho boletsoe esale pele liphuputsong tse fetileng, 7,32,37 sebopeho sa sebaka sa SPCA6 se tšoana le sa IZUMO1 ea motho, 'me liprotheine tse peli li arolelana moelelo o sa tloaelehang: 4HB e nang le mokokotlo oa li-helical tse tharo le lihlopha tse peli tsa CXXC tse amanang le disulfide.Re sisinya hore IZUMO1 le SPCA6 joale li hlalose lelapa le leholoanyane, le amanang le sebopeho sa liprotheine tse amanang le motsoako oa gamete.Re sebelisa likarolo tse ikhethang tsa lelapa le phahameng, re ile ra etsa patlisiso e felletseng ea AlphaFold structural human proteome, ho khetholla litho tse ling tsa lelapa lena le phahameng, ho kenyeletsoa le litho tse 'maloa tse amehang fusion ea gamete le / kapa manyolo.Hona joale ho bonahala eka ho na le lesaka le tloaelehileng la sebopeho le liprotheine tse ngata tse amanang le fusion ea gamete, 'me sebopeho sa rona se fana ka' mapa oa limolek'hule oa karolo ena ea bohlokoa ea mochine oa fusion ea gamete ea motho.
SPCA6 ke protheine ea transmembrane e fetang e le 'ngoe e nang le N-linked glycan e le' ngoe le li-bond tse tšeletseng tsa putative disulfide (Figures S1a le S2).Re hlalositse sebaka sa extracellular sa SPCA6 ea motho (masala a 27-246) liseleng tsa Drosophila S2 'me ra hloekisa protheine ka ho sebelisa nickel affinity, cation exchange, le size exclusion chromatography (Fig. S1b).SPCA6 ectodomain e hloekisitsoeng e tsitsitse haholo ebile e homogeneous.Tlhahlobo e sebelisang boholo ba ho kenyelletsa chromatography e kopantsoeng le ho hasanya ha leseli la polygonal (SEC-MALS) e senotse tlhōrō e le 'ngoe e nang le boima ba limolek'hule ba 26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c).Sena se lumellana le boholo ba SPCA6 monomeric ectodomain, e bontšang hore oligomerization ha ea ka ea etsahala nakong ea tlhoekiso.Ho phaella moo, li-circular dichroism (CD) spectroscopy e ile ea senola sebopeho sa motsoako oa α / β se nang le ntlha ea ho qhibiliha ea 51.3 ° C (Fig. S1d, e).Deconvolution ea CD spectra e senotse 38.6% α-helical le 15.8% β-stranded elements (Figure S1d).
Ectodomain ea SPCA6 e ile ea khabisoa ka ho sebelisa peo ea matrix e sa reroang38 e hlahisang sete ea data e nang le qeto ea 2.2 Å (Letlapa la 1 le Setšoantšo sa S3).Ho sebelisa motsoako oa likaroloana tse thehiloeng ho limolek'hule le data ea SAD ea phasing e nang le tlhahiso ea bromide bakeng sa boikemisetso ba sebopeho (Letlapa la 1 le Setšoantšo sa S4), mohlala oa ho qetela o hloekisitsoeng o na le masala a 27-246.Nakong eo sebopeho se neng se khethoa, ho ne ho se na meaho ea liteko kapa ea AlphaFold e fumanehang.SPCA6 ectodomain e lekanya 20 Å × 20 Å × 85 Å, e na le li-helice tse supileng le likhoele tse robong tsa β, 'me e na le lemeno le phahameng le phahameng le tsitsitseng ka li-bond tse tšeletseng tsa disulfide (Setšoantšo sa 1a, b).Tekanyo e fokolang ea elektronike qetellong ea ketane ea lehlakoreng la Asn243 e bontša hore masala ana ke N-linked glycosylation.Sebopeho se na le libaka tse peli: N-terminal four-helix bundle (4HB) le C-terminal Ig-like domain e nang le sebaka se bohareng sa hinge pakeng tsa bona (setšoantšo sa 1c).
Sebopeho sa sebaka sa extracellular sa SPCA6.Setšoantšo sa Strip sa domain ea extracellular ea SPCA6, 'mala oa ketane ho tloha ho N ho ea ho C-terminus ho tloha ho boputsoa bo lefifi ho ea bofubelu bo lefifi.Li-cysteine ​​​​tse amehang litlamong tsa disulfide li totobatsoa ho magenta.b Topology ea sebaka sa extracellular sa SPCA6.Sebelisa mokhoa o tšoanang oa mebala joaloka setšoantšong sa 1a.c SPCA6 sebaka sa extracellular.Lichate tsa 4HB, hinge, le Ig-like strip strip li na le 'mala oa lamunu, o motala le o moputsoa ka ho latellana.Mekhahlelo ha e huleloe sekaleng.
Sebaka sa 4HB sa SPCA6 se kenyelletsa li-helice tse 'nè tse ka sehloohong (li-helice 1-4), tse hlophisitsoeng ka mokhoa oa helical helix (setšoantšo sa 2a), ho fapanyetsana pakeng tsa li-antiparallel le litšebelisano tse tšoanang (setšoantšo sa 2b).Helix e nyenyane e eketsehileng e le 'ngoe (helix 1′) e behiloe perpendicular ho bongata, e etsa khutlo-tharo e nang le li-helices 1 le 2. Triangle ena e holofetse hanyane ka har'a pakete e sothehileng ea liphutheloana tse batlang li teteane tsa li-helices 3 le 4 ( Setšoantšo sa 2a).
4HB N-terminal strip chate.b Ponahalo e kaholimo ea bongata ba lihelikone tse 'ne, helix e 'ngoe le e 'ngoe e totobalitsoe ka boputsoa bo lefifi ho N-terminus le bofubelu bo loileng ho C-terminus.c Setšoantšo sa mabili a holimo-tlase bakeng sa 4HB, 'me masalla ka 'ngoe a bontšitsoe e le selikalikoe se ngotsoeng khoutu ea amino acid ea tlhaku e le 'ngoe;ke li-amino acid tse 'nè feela tse ka holimo ho lebili tse baloang.Masala a seng a polar a na le 'mala o mosehla, mesaletsa ea polar e sa tjhajwang e na le mebala e tala, masala a nang le li-positive charged a na le 'mala o moputsoa, ​​​​'me masala a nang le litekanyo tse mpe a na le 'mala o mofubelu.d Lifahleho tse khutlo-tharo tsa sebaka sa 4HB, tse nang le 4HBs ka lamunu le lihokelo tse tala.Li-insets ka bobeli li bonts'a libonto tsa disulfide tse sebopeho sa molamu.
4HB e tsepamisitsoe holim'a motsoako oa ka hare oa hydrophobic o entsoeng haholo-holo ka masala a aliphatic le a monko o monate (Setšoantšo sa 2c).Konokono e na le tlamo ea disulfide pakeng tsa Cys41 le Cys55 e hokahanyang li-helices 1 le 2 hammoho ka kgutlotharo e phahameng e phahamisitsoeng (setšoantšo sa 2d).Litlamo tse peli tse eketsehileng tsa disulfide li ile tsa thehoa pakeng tsa CXXC motif ho Helix 1 'le moelelo o mong oa CXXC o fumanoang ntlheng ea β-hairpin sebakeng sa hinge (setšoantšo sa 2d).Masala a conservative arginine a nang le mosebetsi o sa tsejoeng (Arg37) a fumaneha ka hare ho kgutlotharo e sekoti e entsoeng ka li-helices 1′, 1, le 2. Aliphatic carbon atom Cβ, Cγ, le Cδ Arg37 e sebelisana le hydrophobic core, 'me lihlopha tsa eona tsa guanidine li tsamaea ka libaesekele. pakeng tsa li-helices 1 'le 1 ka litšebelisano pakeng tsa mokokotlo oa Thr32 le ketane ea mahlakoreng (Setšoantšo sa S5a,b).Tyr34 e fetela ka har'a sekoti e siea likheo tse peli tse nyane tseo Arg37 e ka kopanang le solvent.
Ig-like β-sandwich domains ke sehlopha se seholo sa liprotheine tse arolelanang tšobotsi e tloaelehileng ea li-amphipathic β-sheets tse peli kapa ho feta tse nang le mefuta e mengata tse sebelisanang ka motsoako oa hydrophobic 39. Sebaka sa C-terminal Ig-like sa SPCA6 se na le mokhoa o tšoanang. 'me e na le lihlopha tse peli (setšoantšo sa S6a).Leqephe la 1 ke β-leqephe la likhoele tse 'nè (likhoele tsa D, F, H, le I) moo likhoele F, H, le 'na li thehang tlhophiso e khahlanong le ho bapisa, 'me likhoele I le D li tšoara tšebelisano e tšoanang.Letlapa la 2 ke letlapa le lenyenyane la li-beta tse khahlanong le parallel tse peli (likhoele E le G).Tlamahano ea ka hare ea disulfide e ile ea hlokomeloa pakeng tsa C-terminus ea ketane ea E le bohareng ba ketane ea H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Tlamo ena ea disulfide e tšoana le tlamo ea disulfide sebakeng sa β-sandwich sa immunoglobulin40,41.
Litlhaku tse 'nè tsa β-sheet li sotheha ka bolelele bohle ba tsona, li etsa mathōko a asymmetrical a fapaneng ka sebōpeho le electrostatics.Moeli o mosesaane ke sebaka sa tikoloho se bataletseng sa hydrophobic se hlahelletseng ha se bapisoa le libaka tse sa tšoaneng tse sa tšoaneng le tsa electrostatically tse fapaneng ho SPCA6 (Fig. S6b, c).Halo ea lihlopha tsa mokokotlo oa carbonyl / amino le liketane tse mahlakoreng a polar li pota-potile sebaka sa hydrophobic (Fig. S6c).Karolo e pharaletseng e koahetsoe ke karolo ea helical e nang le capped e thibelang karolo ea N-terminal ea motsoako oa hydrophobic 'me e etsa li-bonds tse tharo tsa hydrogen le sehlopha se bulehileng sa polar ea mokokotlo oa ketane ea F (Fig. S6d).Karolo ea C-terminal ea moeli ona e etsa pokotho e kholo e nang le karoloana e pepesitsoeng ea hydrophobic core.Pokotho e pota-potiloe ke litefiso tse ntle ka lebaka la lihlopha tse tharo tsa masala a arginine a mabeli (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 le Arg212-Arg214) le histidine e bohareng (His220) (Figure S6e).
Sebaka sa hinge ke karolo e khutšoanyane pakeng tsa sebaka sa helical le sebaka sa Ig-like, se nang le β-layer e le 'ngoe ea antiparallel e nang le mefuta e meraro (likhoele A, B le C), e nyenyane ea 310 helix, le likarolo tse' maloa tse telele tsa helical tse telele.(Setšoantšo sa S7).Khokahano ea likhokahano tsa covalent le electrostatic sebakeng sa hinge e bonahala e tsitsisa maemo lipakeng tsa 4HB le sebaka se kang sa Ig.Marang-rang a ka aroloa likarolo tse tharo.Karolo ea pele e kenyelletsa li-motif tse peli tsa CXXC (27CXXC30 le 139CXXC142) tse etsang li-bond tsa disulfide pakeng tsa β-hairpin ho hinge le 1' helix ho 4HB.Karolo ea bobeli e kenyelletsa litšebelisano tsa electrostatic lipakeng tsa sebaka sa Ig-like le hinge.Glu132 ka hinge e etsa borokho ba letsoai bo nang le Arg233 sebakeng sa Ig-like le Arg135 hinge.Karolo ea boraro e kenyelletsa maqhama a covalent pakeng tsa sebaka se kang sa Ig le sebaka sa hinge.Litlamo tse peli tsa disulfide (Cys124-Cys147 le Cys128-Cys153) li kopanya hinge loop ho sehokelo se tsitsitseng ke litšebelisano tsa electrostatic pakeng tsa Gln131 le sehlopha se sebetsang sa mokokotlo, se lumellang ho fihlella sebaka sa pele sa Ig-like.ketane.
Sebopeho sa SPCA6 ectodomain le mekhoa ea motho ka mong ea 4HB le Ig-like domains e ne e sebelisetsoa ho batla lirekoto tse tšoanang ka mokhoa oa liprotheine tsa 42.Re khethile lipapali tse nang le lintlha tse phahameng tsa Dali Z, liphapang tse nyane tse tloaelehileng, le lintlha tse kholo tsa LALI (ea morao ke palo ea masala a lekanang ka sebopeho).Le hoja li-hits tsa pele tsa 10 tse tsoang ho ectodomain search e feletseng (Letlapa la S1) le ne le e-na le Z-score e amohelehang ea> 842, ho batla 4HB kapa Ig-like domain feela ho bontšitse hore boholo ba lipina tsena li lumellana le β-sandwiches feela.lemeno le fumanehang hohle le fumanoang liprotheineng tse ngata.Lipatlisiso tse tharo ho Dali li khutlisitse sephetho se le seng: IZUMO1.
Ke khale ho khothaletsoa hore SPCA6 le IZUMO1 li arolelane libopeho tse tšoanang7,32,37.Leha li-ectodomains tsa liprotheine tsena tse peli tse amanang le fusion ea gamete li arolelana boitsebiso ba tatellano ea 21% feela (Setšoantšo sa S8a), bopaki bo rarahaneng, ho kenyeletsoa mokhoa o bolokehileng oa bond ea disulfide le sebaka se boletsoeng esale pele sa C-terminal Ig-joaloka SPCA6, se lumelletse liteko tsa pele tsa ho haha mohlala oa homology oa A a SPCA6 toeba o sebelisa IZUMO1 joalo ka template37.Sebopeho sa rona se tiisa likhakanyo tsena 'me se bontša tekanyo ea' nete ea ho tšoana.Ha e le hantle, mehaho ea SPCA6 le IZUMO137,43,44 e arolelana meralo e tšoanang ea li-domain tse peli (Fig. S8b) le libaka tse tšoanang tsa 4HB le Ig-like β-sandwich tse amanang le sebaka sa hinge (Fig. S8c).
IZUMO1 le SPCA6 4HB di na le diphapano tse tlwaelehileng ho tswa ho diphuthelwana tse tlwaelehileng tsa spiral.Li-4HB tse tloaelehileng, tse kang tse fumanoang ho SNARE protheine complexes tse amehang ho endosomal fusion 45,46, li na le li-helice tse lekaneng tse bolokang mokokotlo o sa khaotseng ho pota-pota bohareng ba axis 47. Ka lehlakoreng le leng, libaka tsa helical ho IZUMO1 le SPCA6 li ne li sothehile, li na le li-curvature tse fapaneng. ho paka ho sa lekanang (Setšoantšo sa S8d).Ho sotha, mohlomong ho bakoa ke kgutlotharo e entsoeng ke li-helices 1′, 1 le 2, e bolokoa ho IZUMO1 le SPCA6 mme e tsitsisoa ke moelelo o tšoanang oa CXXC ho helix 1′.Leha ho le joalo, tlamo e eketsehileng ea disulfide e fumanoang ho SPCA6 (Cys41 le Cys55 e hokahanyang lihelise 1 le 2 ka holimo) e theha ntlha e bohale ho triangolo apex, e etsa hore SPCA6 e sothehe ho feta IZUMO1, e nang le likhutlo tse tharo tse hlakileng haholoanyane.Ntle le moo, IZUMO1 ha e na Arg37 e bonoang bohareng ba sebaka sena ho SPCA6.Ka lehlakoreng le leng, IZUMO1 e na le motheo o tloaelehileng oa hydrophobic oa masala a aliphatic le monko o monate.
IZUMO1 e na le sebaka se kang sa Ig se nang le β-sheet43 e likhoele tse peli le tse hlano.Khoele e eketsehileng ho IZUMO1 e nkela sebaka sa coil ho SPCA6, e hokahanang le F strand ho fokotsa mokokotlo oa li-hydrogen bond ka har'a khoele.Ntho e khahlisang ea papiso ke tefiso e boletsoeng esale pele ea libaka tse kang tsa Ig tsa liprotheine tse peli.Sebaka sa IZUMO1 se qosoa hampe ho feta sebaka sa SPCA6.Tefiso e eketsehileng e haufi le C-terminus e shebaneng le lera la peō.Ho SPCA6, libaka tse tšoanang li ne li sa nke lehlakore kapa li lefisoa hantle (Fig. S8e).Mohlala, bokaholimo ba hydrophobic (mathōko a masesane) le likoti tse nang le matla a matle (mathōko a pharaletseng) ho SPCA6 li lefisoa hampe ho IZUMO1.
Le hoja kamano le likarolo tsa sebopeho sa bobeli pakeng tsa IZUMO1 le SPCA6 li bolokiloe hantle, ho lumellana ha sebopeho sa libaka tse kang tsa Ig ho bontšitse hore libaka tse peli li fapane ka mokhoa oa tsona o akaretsang o amanang le o mong (Fig. S9).The spiral bundle ya IZUMO1 e kobehile mabapi le β-sandwich, e bopa sebopeho se hlalositsweng pele sa "boomerang" hoo e ka bang 50° ho tloha bohareng ba axis.Ka lehlakoreng le leng, lebone la helical ho SPCA6 le ne le sekamisitsoe hoo e ka bang 10° ka nqa e fapaneng.Liphapang tsa mekhoa ena li ka etsahala ka lebaka la liphapano tsa sebaka sa hinge.Boemong ba tatellano ea mantlha, IZUMO1 le SPCA6 li arolelana tatellano e fokolang ea ho tšoana ho hinge, ntle le masala a cysteine, glycine, le aspartic acid.Ka lebaka leo, li-bond tsa hydrogen le marang-rang a electrostatic li fapane ka ho feletseng.β-sheet likarolo tsa sebopeho sa bobeli li arolelanoa ke IZUMO1 le SPCA6, leha liketane tsa IZUMO1 li le telele haholo mme 310 helix (helix 5) e ikhethile ho SPCA6.Phapang ena e fella ka litloaelo tse fapaneng tsa domain bakeng sa liprotheine tse peli tse tšoanang.
Patlisiso ea rona ea seva sa Dali e senotse hore SPCA6 le IZUMO1 ke tsona feela likarolo tse peli tse entsoeng liteko tse bolokiloeng polokelong ea liprotheine tse nang le lemeno lena la 4HB (Letlapa la S1).Haufinyane tjena, DeepMind (Alphabet / Google) e thehile AlphaFold, tsamaiso ea methapo ea methapo e ka bolelang ka nepo libopeho tsa 3D tsa liprotheine ho tloha ka tatellano ea mantlha48.Nakoana ka mor'a hore re rarolle sebopeho sa SPCA6, database ea AlphaFold e ile ea lokolloa, e fana ka mehlala ea mekhoa ea ho bolela esale pele e koahelang 98.5% ea liprotheine tsohle tse proteome48,49 ea motho.Ka ho sebelisa sebopeho sa rona sa SPCA6 se rarollotsoeng e le mohlala oa ho batla, phuputso ea homology ea meralo bakeng sa mohlala ho AlphaFold human proteome e ile ea tsebahatsa bonkgetheng ba nang le ho tšoana ho ka bang teng ho SPCA6 le IZUMO1.Ho fanoe ka ho nepahala ho hlollang ha AlphaFold ka ho bolela esale pele SPCA6 (sa feiga. S10a) -haholo-holo 1.1 Å rms ectodomain bapisoa le sebopeho sa rona se rarollotsoeng (sa feiga.
Nakong e fetileng, PSI-BLAST e ne e batla sehlopha sa IZUMO1 se nang le liprotheine tse ling tse tharo tse amanang le peō: IZUMO2, IZUMO3, le IZUMO450.AlphaFold e ile ea bolela esale pele hore liprotheine tsena tsa lelapa la IZUMO li phuthehela sebakeng sa 4HB ka mokhoa o ts'oanang oa bonto ea disulfide joalo ka IZUMO1 (Lipalo 3a le S11), leha li haelloa ke sebaka se kang sa Ig.Ho hakanngoa hore IZUMO2 le IZUMO3 ke liprotheine tsa lera tse lehlakoreng le le leng tse tšoanang le IZUMO1, ha IZUMO4 e bonahala e ntšitsoe.Mesebetsi ea liprotheine tsa IZUMO 2, 3, le 4 ho fusion ea gamete ha e so tsejoe.IZUMO3 e tsejwa ka ho ba le seabo ho acrosome biogenesis nakong ya ntshetsopele ya spermatozoa51, mme protheine ya IZUMO e etsa complex50.Paballo ea liprotheine tsa IZUMO ho liphoofolo tse anyesang, lihahabi le liphoofolo tse phelang metsing le metsing ho fana ka maikutlo a hore tšebetso ea tsona e ka bang teng e lumellana le ea liprotheine tse ling tse tsejoang tse amanang le gamete-fusion, tse kang DCST1/2, SOF1, le FIMP.
Setšoantšo sa meralo ea domain name ea IST superfamily, e nang le 4HB, hinge, le libaka tse kang Ig tse totobalitsoeng ka lamunu, botala le boputsoa ka ho latellana.IZUMO4 e na le sebaka se ikhethileng sa C-terminal se shebahalang se le setšo.Litlamo tsa disulfide tse tiisitsoeng le tse kentsoeng li bontšoa ka mela e tiileng le e matheba, ka ho latellana.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPCA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F95), (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F95) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) li bonts'oa ka mebala e tšoanang le ea phanele A. Li-bond tsa Disulfide li bontšoa ka magenta.Lihele tsa TMEM95, IZUMO2 le IZUMO3 transmembrane ha li bontšoe.
Ho fapana le protheine ea IZUMO, liprotheine tse ling tsa SPCA (ke hore, SPCA1, SPCA3, SPCA4, SPCA5, le SPCA9) ho nahanoa hore li fapane ka sebopeho le SPCA6 (Fig. S12).Ke SPCA9 feela e nang le 4HB, empa ha hoa lebelloa hore e be le mokhoa o ts'oanang oa parallel-anti-parallel kapa bond e tšoanang ea disulfide joalo ka SPCA6.Ke SPCA1 feela e nang le sebaka se tšoanang le sa Ig.AlphaFold e bolela esale pele hore SPCA3, SPCA4 le SPCA5 li na le sebopeho se fapaneng ka ho felletseng ho feta SPCA6.Hoa thahasellisa hore SPCA4 e boetse e tsejoa ka ho bapala karolo ea ho emolisa, empa ho feta SPCA6, ho e-na le hoo e thusa ho sebelisana pakeng tsa peo ea botona le oocyte zona pellucida52.
Patlo ea rona ea AlphaFold e fumane papali e 'ngoe ea IZUMO1 le SPCA6 4HB, TMEM95.TMEM95, protheine e le 'ngoe e khethehileng ea sperm-spembrane, e etsa hore litoeba tsa banna li se ke tsa tsoala ha li tlosoa 32,33.Spermatozoa e haellang TMEM95 e ne e e-na le morphology e tloaelehileng, motility, le bokhoni ba ho phunyeletsa zona pellucida le ho tlama lera la lehe, empa e ne e sitoa ho kopanya le lera la oocyte.Liphuputso tse fetileng li bontšitse hore TMEM95 e arolelana ho tšoana ha sebopeho le IZUMO133.Ha e le hantle, mohlala oa AlphaFold o netefalitse hore TMEM95 ke 4HB e nang le lihlopha tse tšoanang tsa CXXC tse kang IZUMO1 le SPCA6 le tlamahano e tšoanang ea disulfide pakeng tsa li-helices 1 le 2 tse fumanoang ho SPCA6 (Fig. 3a le S11).Le hoja TMEM95 e se na sebaka se kang sa Ig, se na le sebaka se nang le mokhoa oa ho kopanya li-disulfide o tšoanang le libaka tsa li-hinge tsa SPCA6 le IZUMO1 (Setšoantšo sa 3b).Nakong ea ho phatlalatsoa ha buka ena e ngotsoeng ka letsoho, seva sa preprint se tlalehile sebopeho sa TMEM95, se tiisa sephetho sa AlphaFold53.TMEM95 e ts'oana haholo le SPCA6 le IZUMO1 mme e bolokiloe ka mokhoa oa ho iphetola ha lintho e se e ntse e le liphoofolong tse phelang metsing (setšoantšo sa 4 le S13).
Patlisiso ea PSI-BLAST e sebelisitse NCBI SPCA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, le SOF1 databases ho fumana boemo ba tatellano ena sefateng sa bophelo.Libaka tse pakeng tsa libaka tsa makala ha li bontšoe ho lekanngoa.
Ho tšoana ho makatsang ka kakaretso lipakeng tsa SPCA6 le IZUMO1 ho fana ka maikutlo a hore ke litho tse theiloeng tsa lelapa le phahameng la meralo le baballang le kenyeletsang liprotheine tsa TMEM95 le IZUMO 2, 3, le 4.litho tse tsebahalang: IZUMO1, SPCA6 le TMEM95.Hobane ke litho tse 'maloa feela tse nang le libaka tse kang tsa Ig, letšoao la IST superfamily ke sebaka sa 4HB, se nang le likarolo tse ikhethang tse tloaelehileng ho liprotheine tsena kaofela: 1) Coiled 4HB e nang le li-helices tse hlophisitsoeng ka ho fapanyetsana ha anti-parallel / parallel (Fig. 5a), 2) sephutheloana se na le sefahleho sa triangular se nang le li-helice tse peli ka har'a bongata le helix ea boraro e otlolohileng (setšoantšo sa sebaka sa bohlokoa (setšoantšo sa 5c) Setšoantšo sa CXXC, se fumanoang liprotheine tse kang thioredoxin, se tsejoa hore se sebetsa. e le sensor ea redox 54,55,56, athe motif ho litho tsa lelapa la IST e ka amahanngoa le li-isomerase tsa protheine disulfide tse kang ERp57 ho fusion ea gamete.
Litho tsa IST superfamily li hlalosoa ka likarolo tse tharo tse khethollang sebaka sa 4HB: li-helice tse 'nè tse fapanyetsanang pakeng tsa li-parallel le antiparallel orientation, lifahleho tsa ba-triangular helical bundle, le ca CXXC habeli motif e entsoeng pakeng tsa limolek'hule tse nyenyane.) N-terminal helixes (orange) le hinge region β-hairpin (e tala).
Ha ho nahanoa ka ho tšoana ho teng pakeng tsa SPCA6 le IZUMO1, bokhoni ba pele ba ho tlama ho IZUMO1 kapa JUNO bo ile ba lekoa.Biolayer interferometry (BLI) ke mokhoa o tlamang o thehiloeng ho kinetic oo pele o kileng oa sebelisoa ho lekanya tšebelisano pakeng tsa IZUMO1 le JUNO.Ka mor'a ho kenngoa ha sensor e nang le biotin e nang le IZUMO1 e le bait e nang le mahlaseli a mangata a JUNO analyte, pontšo e matla e ile ea fumanoa (Fig. S14a), e bontšang phetoho e tlamang ka har'a botenya ba biomaterial e kopantsoeng le ntlha ea sensor.Lipontšo tse ts'oanang (ke hore, JUNO e kopantsoe le sensor e le bait khahlanong le IZUMO1 analyte) (Fig. S14b).Ha ho pontšo e ileng ea fumanoa ha SPCA6 e ne e sebelisoa e le mohlahlobi khahlanong le IZUMO1 e nang le sensor kapa JUNO-bound JUNO (Figure S14a,b).Ho ba sieo ha pontšo ena ho bontša hore sebaka sa extracellular sa SPCA6 ha se sebelisane le sebaka sa extracellular sa IZUMO1 kapa JUNO.
Hobane tlhahlobo ea BLI e thehiloe ho biotinylation ea masala a lysine a mahala ho protheine ea bait, phetoho ena e ka thibela ho tlama haeba masala a lysine a ameha tšebelisanong.Ntle le moo, ho shebana le setsoalle se tlamang ho sensor ho ka baka litšitiso tsa steric, kahoo litlhahlobo tse tloaelehileng tsa ho theola li ile tsa boela tsa etsoa ho li-recombinant SPCA6, IZUMO1 le JUNO ectodomains.Ho sa tsotellehe sena, SPCA6 ha ea ka ea feta ka IZUMO1 ea Hae-tagged kapa JUNO ea hae (Fig. S14c, d), e bontšang hore ha ho na tšebelisano e lumellanang le e hlokometsoeng litekong tsa BLI.E le taolo e ntle, re netefalitse tšebelisano ea JUNO e ngotsoeng His IZUMO1 (Figures S14e le S15).
Ho sa tsotellehe ho tšoana ha sebopeho pakeng tsa SPCA6 le IZUMO1, ho se khonehe ha SPCA6 ho tlama JUNO ha ho makatse.Bokaholimo ba batho ba IZUMO1 bo na le masala a fetang 20 a sebelisanang le JUNO, ho kenyelletsa le masalla a tsoang ho e 'ngoe le e 'ngoe ea libaka tse tharo (le hoja boholo ba tsona li le sebakeng sa hinge) (Fig. S14f).Ho masala ana, ke e le 'ngoe feela e bolokiloeng ho SPCA6 (Glu70).Leha mesaletsa e mengata e ile ea boloka thepa ea eona ea mantlha ea lik'hemik'hale, masala a bohlokoa a Arg160 ho IZUMO1 a ile a nkeloa sebaka ke Asp148 e qosoang hampe ho SPCA6;liphuputso tse fetileng li bontšitse hore phetoho ea Arg160Glu ho IZUMO1 e batla e felisa ka ho feletseng tlamo ho JUNO43.Ntle le moo, phapang pakeng tsa sebaka sa marang-rang pakeng tsa IZUMO1 le SPCA6 e ile ea eketsa haholo sebaka sa sebaka se tlamang sa JUNO sa sebaka se lekanang ho SPCA6 (Fig. S14g).
Leha ho na le tlhoko e tsebahalang ea SPCA6 bakeng sa fusion ea gamete le ho tšoana ha eona le IZUMO1, SPCA6 ha e bonahale e na le ts'ebetso e ts'oanang ea ho tlama JUNO.Ka hona, re batlile ho kopanya lintlha tsa rona tsa sebopeho le bopaki ba bohlokoa bo fanoeng ke baeloji ea ho iphetola ha lintho.Tatellano ea li-homologue tsa SPCA6 e bonts'a paballo ea sebopeho se tloaelehileng ho feta liphoofolo tse anyesang.Ka mohlala, masala a cysteine ​​​​a teng esita le ho li-amphibians tse amanang le hōle (Setšoantšo sa 6a).Ho sebelisoa seva sa ConSurf, lintlha tse ngata tsa ho boloka tatellano ea tatellano ea 66 li ile tsa etsoa 'mapa sebakeng sa SPCA6.Tlhahlobo ea mofuta ona e ka bontša hore na ke masala afe a bolokiloeng nakong ea phetoho ea liprotheine 'me e ka bontša hore na ke libaka life tse ka holimo tse nang le karolo mosebetsing.
Tatellano ea tatellano ea li-ectodomain tsa SPCA6 tse tsoang mefuta e 12 e fapaneng e lokiselitsoeng ho sebelisoa CLUSTAL OMEGA.Ho latela tlhahlobo ea ConSurf, maemo a thata ka ho fetesisa a tšoailoe ka boputsoa.Masala a cysteine ​​​​a totobalitsoe ka bofubelu.Meeli ea libaka le likarolo tsa sebopeho sa bobeli li bonts'oa ka holimo ho tatellano, moo metsu e bontšang β-strands le maqhubu a bontšang li-helices.Li-Identifiers tsa NCBI Access tse nang le tatelano ke: motho (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), capuchin monkey (Cebus mimic, XP_017359366), pere (Equus 1002 or cabaci3) 23 XP_032_034) .), linku (Ovis aries, XP_014955560), tlou (Loxodonta africana, XP_010585293), ntja (Canis lupus familyis, XP_025277208), mouse (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian156381), Tasmanian156381), Tasmanian 156381), Tasmanian 156381, XP, XPPlus, XP, XPP, , 8) , 61_89 le Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Linomoro li ipapisitse le tatellano ea batho.b Boemeli ba bokaholimo ba sebopeho sa SPCA6 se nang le 4HB holimo le sebaka se kang sa Ig ka tlase, mebala e ipapisitseng le likhakanyo tsa paballo ho tsoa ho seva sa ConSurf.Likarolo tse sirelelitsoeng ka ho fetisisa li na le 'mala o moputsoa, ​​​​likotoana tse bolokiloeng ka mokhoa o itekanetseng li tšoeu,' me tse sa bolokehang li le mosehla.cysteine ​​e pherese.Lipatjana tse tharo tse bontšang tšireletso e phahameng li bontšoa ka har'a sets'oants'o se ngotsoeng lipache 1, 2 le 3. Papali ea 4HB e bontšitsoe setšoantšong se ka holimo ka ho le letona (sekheo sa mebala se tšoanang).
Sebopeho sa SPCA6 se na le libaka tse tharo tse sirelelitsoeng haholo tsa holim'a metsi (Setšoantšo sa 6b).Patch 1 e na le 4HB le sebaka sa hinge 'me e na le marokho a mabeli a bolokiloeng a CXXC a disulfide, marang-rang a hinge a Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7), le masala a mararo a bolokiloeng ka ntle a monko o monate (Phe31, Tyr73, Phe137).leqhubu le pharaletseng la sebaka sa Ig-like (Fig. S6e), e emelang masala a 'maloa a qosoang hantle holim'a peō ea botona.Ho khahlisang, patch ena e na le epitope ea antibody eo pele e bonts'itsoeng ho kena-kenana le ts'ebetso ea SPCA6 30.Sebaka sa 3 se pota-potile hinge le lehlakore le le leng la sebaka se kang sa Ig;sebaka sena se na le li-proline tse bolokiloeng (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) le masala a shebileng ka ntle a polar/a qosoa.Hoa makatsa hore ebe boholo ba masala a holim'a 4HB a fapane haholo (setšoantšo sa 6b), le hoja lesaka le bolokiloe ho pholletsa le homologue ea SPCA6 (joalokaha ho bontšoa ke conservatism ea hydrophobic bundle core) le ho feta IST superfamily.
Le hoja ena e le sebaka se senyenyane ka ho fetisisa ho SPCA6 se nang le likarolo tse fokolang tsa sebopeho sa bobeli se bonahalang, masala a mangata a sebaka sa hinge (ho kenyeletsoa le sebaka sa 3) a bolokiloe haholo har'a li-homologues tsa SPCA6, tse ka bontšang hore mokhoa oa helical bundle le β-sandwich o phetha karolo.joalo ka motho ea baballang.Leha ho le joalo, leha ho na le marang-rang a mangata a haedrojene le marang-rang a motlakase sebakeng sa hinge sa SPCA6 le IZUMO1, bopaki ba ho feto-fetoha ha maemo ho ka bonoa ho lokisoeng ha meaho e mengata e lumelletsoeng ea IZUMO137,43,44.Ho lokisoa ha libaka tsa motho ka mong ho ne ho fetana hantle, empa ho shebana ha libaka tse amanang le tse ling ho ne ho fapane ho tloha ho 50 ° ho ea ho 70 ° ho tloha bohareng ba axis (Fig. S16).Ho utloisisa matla a conformational a SPCA6 ka tharollo, liteko tsa SAXS li ile tsa etsoa (setšoantšo sa S17a, b).Ab initio reconstruction ea SPCA6 ectodomain e lumellana le mohaho oa kristale oa molamu (setšoantšo sa S18), le hoja morero oa Kratky o bontšitse tekanyo e itseng ea ho feto-fetoha ha maemo (setšoantšo sa S17b).Khokahano ena e fapana le IZUMO1, eo ho eona protheine e sa tlamisoang e nkang sebopeho sa boomerang ka har'a lesela le tharollo43.
E le ho khetholla ka ho khetheha sebaka se feto-fetohang, hydrogen-deuterium exchange mass spectroscopy (H-DXMS) e ile ea etsoa SPCA6 'me ha e bapisoa le lintlha tse fumanoeng pele ho IZUMO143 (Setšoantšo sa 7a,b).SPCA6 e hlakile ho feta IZUMO1, joalo ka ha ho bontšoa ke phapanyetsano e phahameng ea deuterium ho pholletsa le sebopeho ka mor'a 100,000 s ea phapanyetsano.Meahong ka bobeli, karolo ea C-terminal ea sebaka sa hinge e bonts'a phapanyetsano e phahameng, eo mohlomong e lumellang ho potoloha ho lekanyelitsoeng ha libaka tse kang 4HB le Ig tse amanang le tse ling.Hoa thahasellisa hore karolo ea C-terminal ea hinge ea SPCA6, e nang le masala a 147CDLPLDCP154, ke sebaka se sirelelitsoeng haholo sa 3 (setšoantšo sa 6b), mohlomong se bontšang hore ho feto-fetoha ha li-interdomain ke tšobotsi e bolokiloeng ka ho iphetola ha lintho ea SPCA6.Ho ea ka tlhahlobo ea ho feto-fetoha ha maemo, data ea CD thermal melt e bontšitse hore SPCA6 (Tm = 51.2 ° C) ha e tsitsa ho feta IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (Fig. S1e le S19).
a H-DXMS litšoantšo tsa SPCA6 le b IZUMO1.Liphesente tsa phapanyetsano ea deuterium li khethiloe ka linako tse bontšitsoeng.Maemo a phapanyetsano ea hydrogen-deuterium a bontšoa ka 'mala ka tekanyo ea gradient ho tloha ho putsoa (10%) ho ea ho khubelu (90%).Mabokose a matšo a emela libaka tsa phapanyetsano e phahameng.Meeli ea 4HB, hinge le Ig-like domain e hlokometsoeng mohahong oa kristale e bontšoa ka holimo ho tatellano ea mantlha.Maemo a phapanyetsano ea li-Deuterium ho 10 s, 1000 s, le 100,000 s a ile a raloa holim'a chate e hlobolisang e behiloeng holim'a limolek'hule tse bonaletsang tsa SPCA6 le IZUMO1.Likarolo tsa meaho tse nang le boemo ba phapanyetsano ea deuterium ka tlase ho 50% li na le 'mala o mosoeu.Libaka tse ka holimo ho 50% ea phapanyetsano ea H-DXMS li mebala ka tekanyo ea gradient.
Tšebeliso ea CRISPR/Cas9 le maqheka a liphatsa tsa lefutso tsa mouse a lebisitse ho khethoeng ha lintlha tse 'maloa tsa bohlokoa bakeng sa ho tlama lehe le ho kopanya.Ntle le ho sebelisana hantle ha IZUMO1-JUNO le sebopeho sa CD9, boholo ba liprotheine tse amanang le fusion ea gamete li lula li le teng ka mokhoa o hlophisitsoeng le o sebetsang hantle.Sebopeho sa biophysical le sebopeho sa SPCA6 ke karolo e 'ngoe ea papali ea molek'hule ea adhesion/fusion nakong ea kemolo.
SPCA6 le litho tse ling tsa IST superfamily li bonahala li babaletsoe haholo ho liphoofolo tse anyesang hammoho le linonyana ka bomong, lihahabi le liphoofolo tse phelang metsing;ha e le hantle, ho nahanoa hore SPCA6 e bile e hlokeha bakeng sa ho nontša ho zebrafish 59. Kabo ena e tšoana le liprotheine tse ling tse tsejoang tse amanang le gamete fusion tse kang DCST134, DCST234, FIMP31, le SOF132, e leng se bontšang hore lintlha tsena ha li na HAP2-hape (hape tse tsejoang ka hore ke liprotheine tsa GCS1) tse ikarabellang bakeng sa ts'ebetso e matla ea baetsi ba litšoantšo ba bangata., limela, le arthropods.Liprotheine tse kopantsoeng ka manyolo 60, 61. Ho sa tsotellehe ho tšoana ho matla ha sebopeho pakeng tsa SPCA6 le IZUMO1, ho kokota ha liphatsa tsa lefutso tse kenyang e 'ngoe ea liprotheine tsena ho ile ha fella ka ho hloka thari ho litoeba tse tona, e leng se bontšang hore mesebetsi ea bona ho fusion ea gamete ha e kopitsoe..Ka ho pharaletseng haholoanyane, ha ho le e 'ngoe ea liprotheine tse tsejoang tsa peō e hlokahalang bakeng sa karolo ea ho khomarela ea fusion e sa sebetseng.
E ntse e le potso e bulehileng hore na SPCA6 (le litho tse ling tsa IST superfamily) li kenya letsoho mefuteng ea li-intergametic, li theha marang-rang a intragametic ho bokella liprotheine tsa bohlokoa ho lintlha tsa fusion, kapa mohlomong le ho sebetsa e le li-fusogens tse thata.Lithuto tsa Co-immunoprecipitation liseleng tsa HEK293T li senotse tšebelisano lipakeng tsa bolelele bo felletseng ba IZUMO1 le SPCA632.Leha ho le joalo, li-ectodomain tsa rona tse recombinant ha lia ka tsa sebelisana ka har'a vitro, li fana ka maikutlo a hore litšebelisano tse bonoang ho Noda et al.ka bobeli li ile tsa hlakoloa ha ho hahoa (hlokomela mohatla oa cytoplasmic oa IZUMO1, o bontšitsoeng o sa hlokahale bakeng sa manyolo62).Ntle le moo, IZUMO1 le/kapa SPCA6 e ka hloka ditikoloho tse tlamang tse itseng tseo re sa di hlahiseng ka invitro, tse jwalo ka metswako e ikgethang ya fisioloji kapa dimolek'hule tse nang le diprotheine tse ding (tse tsebahalang kapa tse esong ho fumanwe).Leha ho lumeloa hore IZUMO1 ectodomain e hokahanya sehokelo sa spermatozoa lehe le sebakeng sa perivitelline, sepheo sa SPCA6 ectodomain ha sea hlaka.
Sebopeho sa SPCA6 se senola libaka tse 'maloa tse bolokiloeng tse ka' nang tsa ameha litšebelisanong tsa protheine le protheine.Karolo e bolokiloeng ea sebaka sa hinge e haufi le CXXC motif (e khethiloeng Patch 1 ka holimo) e na le masalla a 'maloa a monko o monate a shebaneng le kantle ao hangata a amahanngoang le tšebelisano ea hydrophobic le π-stacking lipakeng tsa biomolecules.Mahlakore a pharaletseng a sebaka sa Ig-like (sebaka sa 2) a theha groove e nang le tjhaja e ntle e nang le Arg e bolokiloeng haholo le masala a Hae, 'me li-antibodies khahlanong le sebaka sena li kile tsa sebelisoa ho thibela fusion ea gamete 30.Sethibela-mafu se lemoha linear epitope 212RIRPAQLTHRGTFS225, e nang le masalla a mararo ho a tšeletseng a arginine le His220 e bolokiloeng haholo.Ha ho hlake hore na ho se sebetse ho bakoa ke ho thibeloa ha masala ana a khethehileng kapa sebaka sohle.Sebaka sa lekhalo lena haufi le C-terminus ea β-sandwich e bontša litšebelisano tsa cis le liprotheine tsa peō ea boahelani, empa eseng le liprotheine tsa oocyte.Ho feta moo, ho bolokoa ha tangle e ruileng ea proline e feto-fetohang haholo (sebaka sa 3) ka har'a hinge e ka 'na ea e-ba sebaka sa ho sebelisana ha protheine kapa, mohlomong, ho bontša ho boloka ho fetoha ha maemo pakeng tsa libaka tse peli.Bong bo bohlokoa bakeng sa karolo e sa tsejoeng ea SPCA6.ho kopana ha gametes.
SPCA6 e na le litšobotsi tsa liprotheine tse kopanyang tse kopanyang, ho kenyelletsa le li-sandwich tsa Ig-like β.Liprotheine tse ngata tsa sekhomaretsi (mohlala, li-cadherins, integrins, adhesin, le IZUMO1) li na le sebaka se le seng kapa ho feta sa β-sandwich tse eketsang liprotheine ho tloha lera la sele ho ea ho lipakane tsa tsona tsa tikoloho63,64,65.Sebaka sa Ig-like sa SPCA6 se boetse se na le motif e atisang ho fumanoa ho β-sandwiches of adhesion and cohesion: li-double tsa likhoele tse bapileng lipheletsong tsa β-sandwich, tse tsejoang e le mechanical clamps66.Ho lumeloa hore motif ena e eketsa ho hanyetsa matla a ho kuta, e leng a bohlokoa bakeng sa liprotheine tse amehang litšebelisanong tsa intercellular.Leha ho le joalo, ho sa tsotellehe ho tšoana hona le li-adhesin, hajoale ha ho na bopaki ba hore SPCA6 e sebelisana le makhooa a mahe.Ectodomain ea SPCA6 ha e khone ho tlama ho JUNO, le lisele tsa HEK293T tse hlalosang SPCA6, joalokaha ho bontšitsoe mona, ha li kopane ka thata le li-oocyte tse haelloang ke zona 32.Haeba SPCA6 e theha maqhama a intergametic, litšebelisano tsena li ka hloka liphetoho tsa morao-rao kapa ho tsitsisoa ke liprotheine tse ling tsa peō.E le ho tšehetsa khopolo-taba ea ho qetela, spermatozoa e haelloang ke IZUMO1 e tlama li-oocyte, e bontšang hore limolek'hule tse ling ntle le IZUMO1 li ameha mohato oa 27 oa ho khomarela gamete.
Liprotheine tse ngata tsa kokoana-hloko, lisele le nts'etsopele ea fusion li na le thepa e bolelang esale pele mosebetsi oa tsona e le fusogens.Ka mohlala, viral fusion glycoproteins (lihlopha tsa I, II le III) li na le peptide ea hydrophobic fusion kapa loop qetellong ea protheine e kenngoa ka har'a lera la moeti.'Mapa oa hydrophilicity oa IZUMO143 le sebopeho (se reriloeng le se boletsoeng esale pele) sa lelapa le phahameng la IST ha se bontše peptide e hlakileng ea hydrophobic fusion.Kahoo, haeba liprotheine tse ho IST superfamily li sebetsa joalo ka fusogens, li etsa joalo ka mokhoa o fapaneng le mehlala e meng e tsebahalang.
Qetellong, mesebetsi ea litho tsa IST superfamily ea liprotheine tse amanang le fusion ea gamete e ntse e le sephiri se tsotehang.Molek'hule ea rona e kopantsoeng ea SPCA6 le sebopeho sa eona se rarollotsoeng li tla fana ka leseli mabapi le likamano lipakeng tsa meaho ena e arolelanoang le karolo ea bona ho sehokelo sa gamete le fusion.
Tatelano ea DNA e tsamaellanang le e boletsoeng esale pele ea SPCA6 ectodomain ea motho (Nomoro ea ho kena ea NCBI NP_001303901.1; masalla 27–246) e ile ea ntlafatsoa ka mokhoa oa codon bakeng sa ho hlahisa lisele tsa Drosophila melanogaster S2 'me ea etsoa e le sekhechana sa lefutso ka tatellano ea khouto ea GeknomicEncoding Koza., lets'oao la BiP la secretion le 5′ le 3′ tse tsamaellanang le 5′ le 3′ bakeng sa ho kopanngoa ho ikemetseng ha gene ena ho ba vector ea polelo ea pMT e thehiloeng ho motšehetsi oa metallothionein o fetotsoeng bakeng sa khetho ka puromycin (pMT-puro).PMT-puro vector e kopanya sebaka sa thrombin cleavage se lateloang ke 10x-His C-terminal tag (Setšoantšo S2).
Phetiso e tsitsitseng ea SPCA6 pMT-puro vector ho lisele tsa D. melanogaster S2 (Gibco) e ile ea etsoa ka mokhoa o ts'oanang le protocol e sebelisoang bakeng sa IZUMO1 le JUNO43.Lisele tsa S2 li ile tsa qhibiliha 'me tsa lengoa ka har'a Schneider's medium (Gibco) e tlatsitsoeng ka motsoako oa ho qetela oa 10% (v/v) o sa sebetseng mocheso oa fetal calf serum (Gibco) le 1X antimycotic antibiotic (Gibco).Lisele tsa pele (lisele tsa 3.0 x 106) li ne li kenngoa ka liliba ka bomong tsa lipoleiti tse 6 tsa seliba (Corning).Kamora lihora tse 24 tsa ho fuama ka 27°C, lisele li ile tsa fetisoa ka motsoako oa 2 mg oa SPCA6 pMT-puro vector le Effectene transfection reagent (Qiagen) ho ea ka protocol ea moetsi.Lisele tse fetisitsoeng li ile tsa ekeletsoa lihora tse 72 eaba li kotuloa ka 6 mg/ml puromycin.Lisele li ile tsa aroloa ho tsoa ho Schneider's medium e felletseng 'me tsa behoa ka har'a serum e sa hlokeng Likokoanyana-XPRESS medium (Lonza) bakeng sa tlhahiso e kholo ea protheine.A 1 L batch ea S2 cell culture e ile ea holisoa ho 8-10 × 106 ml-1 lisele ka har'a 2 L ventilated flat-bottomed polypropylene Erlenmeyer 'me ea hloekisoa ka motsoako oa ho qetela oa 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) le e hloekisitsoeng e hloekisitsoeng.hlohlelletse.Litloaelo tse hlohlellelitsoeng li ile tsa kenngoa ka 27 ° C. ka 120 rpm ka matsatsi a mane.
Sebaka se nang le maemo se nang le SPCA6 se ne se arotsoe ke centrifugation ho 5660 × g ho 4 ° C e lateloa ke Centramate tangential flow filtration system (Pall Corp) e nang le lesela la 10 kDa MWCO.Etsa kopo ea mahareng e nang le SPCA6 ho kholomo ea 2 ml ea Ni-NTA agarose resin (Qiagen).Resin ea Ni-NTA e ile ea hlatsuoa ka li-volumes tse 10 (CV) ea buffer A 'me joale CV e le 'ngoe ea buffer A e ile ea kenngoa ho fana ka maikutlo a ho qetela a imidazole a 50 mmM.SPCA6 e ile ea hlakisoa ka 10 ml ea buffer A e tlatsitsoeng ka imidazole ho ea ho 500 mmM ea ho qetela.Thibelo sehlopha sa thrombin (Millipore Sigma) se ile sa kenngoa ka ho toba ho dialysis tubing (MWCO 12-14 kDa) ho 1 unit ka mg SPCA6 vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 le 150 mM NaCl (buffer B) bakeng sa dialysis.) ho 4°C bakeng sa lihora tse 48.Joale SPCA6 e nang le thrombin e ile ea hlapolloa ka makhetlo a mararo ho fokotsa letsoai le ho kenngoa holim'a kholomo ea phapanyetsano ea cation ea 1 ml MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) e lekanang le 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.Mochini oa cation o ile oa hlatsuoa ka 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, eaba SPCA6 e hlatsuoa ka linear gradient ho tloha 0 ho ea 500 mm NaCl ka 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 bakeng sa 25 OK.Ka mor'a ion exchange chromatography, SPCA6 e ne e tsepamisitsoe ho 1 ml 'me ea hlakoloa ka mokhoa o ikhethileng ho tloha ho ENrich SEC650 10 x 300 kholomo (BioRad) e kopantsoeng le buffer B. Ho latela chromatogram, pool and concentrate fractions e nang le SPCA6.Bohloeki bo ne bo laoloa ke Coomassie-stained electrophoresis ka gel ea 16% SDS-polyacrylamide.Pontšo ea protheine e ile ea lekanyetsoa ka ho monya ho 280 nm ho sebelisoa molao oa Beer-Lambert le coefficient ea theoretical molar extinction.
SPCA6 e hloekisitsoeng e ile ea hlajoa ka bosiu bo le bong khahlanong le 10 mM sodium phosphate, pH 7.4 le 150 mM NaF 'me ea hlapolloa ho 0.16 mg / mL pele ho tlhahlobo ea CD spectroscopy.Ho hlahlojoa ha li-CD tse nang le maqhubu a bolelele ba 185 ho ea ho 260 nm ho ile ha bokelloa ho Jasco J-1500 spectropolarimeter ho sebelisa li-quartz cuvettes tse nang le 1 mm optical path length (Helma) ho 25 ° C ka tekanyo ea 50 nm / min.CD spectra e ile ea lokisoa, ea lekanngoa ho feta 10, 'me ea fetoloa ho bolela "residual elliptical" (θMRE) ka likhato cm2/dmol:
moo MW e leng boima ba molek'hule ea sampole ka 'ngoe ho Da;N ke palo ea li-amino acid;θ ke ellipticity ka millidegrees;d e lumellana le bolelele ba tsela ea optical ka cm;khatello ea protheine ka likarolo.